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知识百科


乐虎国际官方网页报道ELISA检测方法应用_乐虎国际官方网页官网资讯

文章类别:知识百科| 公布日期:2013.11.09

方法一:

用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被:用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃ 留宿。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。简称洗涤,下同。2. 加样:加肯定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。同时做空缺孔,阴性比拟孔及阳性比拟孔。3. 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新奇稀释的酶标抗体经滴定后的稀释度0.1ml。37℃ 孵育0.5~1小时,洗涤。4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃ 10~30分钟。5. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测OD值:在ELISA检测仪上,于450nm若以ABTS显色,则410nm处,以空缺比拟孔调零后测各孔OD值,若大于规定的阴性比拟OD值的2.1倍,即为阳性。

ELISA检测方法应用

方法二:

用于检测未知抗体的间接法:用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃留宿。次日洗涤3次。加肯定稀释的待检样品未知抗体0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。同时做空缺、阴性及阳性孔比拟于反应孔中,加入新奇稀释的酶标第二抗体抗抗体0.1ml,37℃孵育30-60分钟,洗涤,最后一遍用DDW洗涤。别的程序同“双抗体夹心法”的4、5、6。

注意事项:

1. 正式实验时,应分别以阳性比拟与阴性比拟操纵实验条件,待检样品应作一式二份,以保证实验结果的精确性。有时本底较高,说明有非特异性反应,可采纳羊血清、兔血清或BSA等封闭。

2. 在ELISA中,进行各项实验条件的选择是很重要的,其中包括:(1)固相载体的选择:许多物质可作为固相载体,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式能够是凹孔平板、试管、珠粒等。当前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不论何种载体,在使用前均可进行筛选:用等量抗原包被,在同一实验条件下进行反应,观察其显色反应是否均一性,据此判明其吸附性能是否良好。(2) 包被抗体或抗原的选择:将抗体或抗原吸附在固相载体外貌时,要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0~9.6之间。吸附温度,时间及其蛋白量也有肯定影响,一般多采纳4℃ 18~24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定:即用差别的蛋白质浓度0.1、1.0和10μg/ml等进行包被后,在其它实验条件相同时,观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对付多数蛋白质来说通常为1~10μg/ml。

3 酶标志抗体工作浓度的选择:首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定见酶标志抗体部份。然后再固定其它条件或采纳“方阵法”包被物、待检样品的参考品及酶标志抗体分别为差别的稀释度在正式实验系统里精确地滴定其工作浓度。

4 酶的底物及供氢体的选择:对供氢体的选择要求是价廉、安定、有显著地显色反应,而本身无色。有些供氢体如OPD等有潜在的致癌作用,应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体,如TMB和ABTS是当前较为满足的供氢体。底物作用一段时间后,应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间,以10-30分钟为宜。底物使用液必须新奇配制,特别是H2O2在临用前加入。




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